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化妆品温和无刺激功效测试方法介绍:如何宣称温和无刺激功效评价
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  • 2024-06-26

    随《化妆品功效宣称评价规范》(国家药监局公告2021年第50号)明确提及宣称温和(如无刺激)应当通过化妆品功效宣称评价试验方式,可以同时结合文献资料或研究数据分析结果,进行功效宣称评价。而特定宣称的化妆品(如宣称适用敏感皮肤、宣称无泪配方),应当通过人体功效评价试验或消费者使用测试的方式进行功效宣称评价。着《化妆品功效宣称评价规范》的发布,市场对温和无刺激功效测试的需求剧增。


    本文提及的化妆品温和无刺激功效测试方法可满足化妆品温和(无刺激)功效评价的基本要求,可作为化妆品温和(无刺激)功效评价的测试方法,测试结果可以支撑产品备案,将更好规范化妆品功效宣称评价工作。


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    中科检测是专业的化妆品检测与功效评价中心,经国家药品监督管理部门确认可承担化妆品注册和备案检验等工作,可提供化妆品温和无刺激功效评价试验服务。


    一、牛眼测试


    试验接受标准:


    如果阳性对照给出的值落在IVIS历史平均值的两个标准偏差范围内,则认为测试是可以接受的。阴性对照的浊度值和渗透性值应小于用阴性对照处理的牛角膜的浊度值和渗透性值的既定上限。当测试样品的预测结果是明确的时候,由至少三个角膜组成的单次测试便足以评价测试样品。


    但是,如果在第一次测试中出现临界值,应考虑进行第二次测试。如果两次测试的预测结果都不一致的情况下,考虑进行第三次测试。


    如果在第一次测试中,3个角膜的预测不一致,则第一次测试运行的结果被认为是临界值,例如以下情况:3个角膜中有2个角膜的预测结果与3个角膜的平均值的预测结果不一致时,或3个角膜中的1个角膜的预测结果与3个角膜的平均值的预测结果不一致,并且,这一个角膜的IVIS结果高于55这个截止阈值10个IVIS单位。


    如果第二次测试结果与第一次测试结果一致,则直接给出最终结果。


    如果第二次测试结果与第一次测试结果不一致,则应进行第三次测试,以判定测试样品的刺激性分类。如果在任何一次测试中得到分类1的预测结果,则可以不需要再进行下一轮测试。


    二、鸡胚测试


    (一)HET-CAM测试:刺激评分法


    试验接受标准:如果试验设定的阴性对照和阳性对照产生的反应结果正好分别在非刺激性和强刺激性的分类范围内,则认为试验结果是可接受的。


    历史对照研究表明,采用0.9%氯化钠作为阴性对照,IS的值是0.0。采用1%SDS和0.1mol/L氢氧化钠作为阳性对照,IS值的范围在10到19之间。每组至少6只鸡胚,取受试物0.3mL直接滴加于CAM表面,观察CAM反应情况,并记录作用5min内每种毒性效应出现的时间,精确到秒,包括出血、凝血和血管融解3种反应,并记录反应的程度。


    刺激评分法结果评价:


    刺激评分IS<1:无刺激性Non-irritant(NI)


    1≤刺激评分IS<5:轻度刺激性Slightlyirritant(SI)


    5≤刺激评分IS<9:中度刺激性Moderatelyirritant(MI)


    刺激评分IS≥10:强刺激性/腐蚀性Strongirritant/Corrosive(Co)


    (二)HET-CAM测试:终点评分法


    试验接受标准:如果试验设定的阴性对照和阳性对照产生的反应结果正好分别在非刺激性和强刺激性的分类范围内,则认为试验结果是可接受的。历史对照研究表明,采用0.9%氯化钠作为阴性对照,IS的值是0.0。采用1%SDS和0.1mol/L氢氧化钠作为阳性对照,IS值的范围在10到19之间。每组至少6只鸡胚,取受试物0.3mL直接滴加于CAM表面,观察CAM反应情况,作用3min后,用生理盐水轻轻冲洗去除受试物,并在冲洗后约30s内观察出血、凝血和血管融解3种反应及程度。如果观察表明全部6只鸡胚至少1种反应的评分为中度以上(总评分≥12),试验应重复一次。


    终点评分法结果评价:


    无/轻刺激性:ES≤12


    中度刺激性:12


    强刺激性/腐蚀性:ES≥16


    (三)CMAVA测试


    毒性效应包括出血、毛细血管充血和鬼影血管,进行严重程度的区分。


    若观察到任何的血管变化,则可认定血管反应为阳性。记录全部的阳性或阴性效应,用概率分析计算RC50,即导致50%的鸡胚显示阳性反应的被测物的浓度。


    三、皮肤模型测试


    试验步骤:


    1、皮肤模型准备:将预温的维持培养液加入12孔培养板2mL/孔,把皮肤模型转移至含有维持培养液的12孔板中,放入培养箱培养过夜。


    2、待测样品与MTT反应:加入MTT溶液和待测样品10μL至12孔板,充分混匀,培养箱中孵育。


    3、加样:取测试样品(包括NC和PC),均匀涂抹皮肤模型表面,室温放置后,用DPBS彻底冲洗样品至无残留,然后置于含新鲜维持培养液的孔中进行孵育。每组设置3个平行。


    4、将皮肤模型放入含MTT溶液的孔中,并放入培养箱培养。MTT反应结束后,用打孔器取下表皮组织,移至EP离心管中,每管加入盐酸异丙醇,充分混匀后室温避光放置过夜。每管取溶液于96孔板中,在570nm处读取OD值。以盐酸异丙醇为空白对照。