抗菌肽是生物体在抵御病原微生物的防御反应过程中产生的一类具有抗菌作用的小分子多肽，其特有的氨基酸组成与结构可以破坏细菌细胞膜结构，导致其死亡。抗菌肽不仅具广谱抗菌活性，对多种肿瘤细胞和癌实体瘤的生长均有明显抑杀作用，且安全无毒、具有保健作用。因此，抗菌肽具有十分广阔的应用前景。测定抗菌肽活性的方法有很多种，其中定性方法主要是琼脂扩散法、包括滤纸片法、平板打孔法和牛津杯法，三者都是通过抑菌圈的大小来直观反映其抑菌活性；定量方法主要是酶标比浊法和活菌计数法。

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　　抗菌活性检测用菌

　　乳酸链球菌素(Nisin)是抗菌肽的典型代表，是已知的具有抗菌作用的一类活性多肽，有研究表明，Nisin能抑制大部分革兰氏阳性菌(G菌)及其芽孢的生长繁殖，但对革兰氏阴性菌(G菌)、酵母菌和菌没有明显作用16%。

　　因此，本实验选取肉制品中常见的3种革兰氏阳性腐败菌：金黄色葡萄球菌、溶血性葡萄球菌和枯草芽孢杆菌为实验菌，研究多种抑菌率测定方法在评价不同质量浓度Nisin抑菌效果时的优缺点，旨在为抗菌肽筛选及抑菌作用的评价提供方法学参考。

　　抗菌活性检测方法

　　1、菌液的制备

　　无药条件下，将甘油保藏的菌种连续活化2次。取活化后的新鲜菌液离心弃去营养肉汤，再用无菌营养肉汤将其稀释至10^4CFU/mL备用。

　　2、不同质量浓度Nisin溶液配制

　　根据GB2760-2011《食品添加剂使用标准》中对于Nisin使用限量要求，用无菌水配制不同质量浓度的Nisin溶液，其质量浓度范围为0.00~0.50gL。

　　3、琼脂扩散法

　　1）牛津杯法

　　牛津杯法又称为管碟法，是国内外测定抗生素效价的通用方法。具体方法为细菌平板计数琼脂121℃、15min高压灭菌后倒板，每皿15mL(下层)，凝周后，再将一定浓度的菌悬液与上述培养基(冷却至45℃)混合均匀，加5mL到已经凝固的培养基上(上层)。以无菌操作在培养基表面垂直放上牛津杯(内径6mm、外径8mm、高10mm的圆形小管)，保证其与培养基之间无空隙，再在杯中加入一定质量浓度的Nisin溶液100L，以生理盐水作为对照。每组3个平板，37℃培养24h后观察其抑菌圈大小，取平均值。

　　2）打孔法

　　先将灭菌的外径为8mm的牛津杯放置在平板中央位置，将一定浓度的菌悬液与灭菌后培养基(冷却至45℃)混合均匀后倒板，均匀倒在牛津杯周围，每且15~20mL。凝固后，用镊子将牛津杯夹出，则形成直径8mm的孔润，孔内注入不同质量浓度Nisin溶液100μL，以生理盐水作为对照。每组3个平板，37℃培养24h后观察其抑菌圈大小，取平均值。

　　3）滤纸片法

　　滤纸折叠为8层后用打孔器制成直径6mm的圆形滤纸片，121℃高温灭菌后干燥备用。灭菌后培养基制成不含菌的平板，待平板凝固后吸取200L菌液均匀涂布于培养基表面。将准备好的滤纸片置于平板中央，吸取不同质量浓度Nisin溶液100μL，缓慢滴加于滤纸片上，以生理盐水作为对照。每组3个平板，37℃培养24h后观察其抑菌圈大小，取平均值。

　　4）酶标比浊法

　　取活化后菌液浓度为10^4CFU/mL金黄色葡萄球菌菌液，接种于营养肉汤中得到3.01g(CFU/g)菌液，分别加入不同质量浓度的Nisin溶液，使其质量浓度范围为0.00~0.50gL，在30℃培养48h后测定菌液OD600nm，每组做3个平行：以添加生理盐水作为对照组。按照式(1)计算抑菌率。

　　5）活菌计数法

　　分别吸取10^4CFU/mL的细菌培养物500μL到无菌的Eppendorf管中，一管为实验管，一管为对照管。实验管中分别加入不同质量浓度的Nisin500μL，总体积为1mL，使其质量浓度为0.00~0.50g；对照管中加入等体积的无菌生理盐水，每个质量浓度做3个平行。各管混匀后，放在37℃条件下振荡孵育1h后分别作10、10^2、10^3倍稀释，每个稀释度分别取100μL涂布于平板计数琼脂上，37℃培养24h后观察并记录每板上的菌落数。根据稀释度和涂布接种鬣计算出每管原液中的细菌数量，按照下式计算抑菌率。

　　抑菌率/%=（对照管细菌数量-实验管细菌数量）/对照管细菌数量