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什么是抑菌环试验?两大抑菌环试验详解
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  • 2023-07-14

目前检测抗(抑)菌产品对细菌、真菌的抗(抑)菌作用的常用试验方法有抑菌环试验、最小抑菌浓度测定试验等。其中抑菌环试验是最常用的抗(抑)菌测试方法,被实验室广泛采用,操作相对简单易行、结果可靠。抑菌环法是利用抑菌剂不断溶解经琼脂平板扩散,使其周围的细菌、真菌生长受到抑制而形成抑菌环,通过测量抑菌环大小来判断该产品是否具有抑菌能力。


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抑菌环试验是什么?


2012版《消毒技术规范》中提及的抑菌环试验是采用的滤纸片法,试验需准备5mm直径圆形新华一号定性滤纸片,经压力蒸汽灭菌处理后,置120℃烤干2h,保存备用,且对于需进行试验的液体产品及溶出性产品分别做了方法说明。对于液体抑菌剂,需在每片滤纸上滴加实际使用浓度抑菌剂溶液20微升,将滤纸片平放于清洁的无菌平皿内,开盖置37℃温箱中烤干,或置室温下自然干燥备用。


对于溶出性抗(抑)菌产品,方法里写明可直接制成直径为5mm,厚不超过4mm圆片(块)来进行试验,但从实际操作来看,尤其对于一些半固态的,如膏霜、牙膏等粘稠产品,将产品直接制成这个指定规格的圆块并不容易操作,规格大小也很难统一,试验结果存在较大误差。


因此,待测产品如若类似膏霜、牙膏等粘稠产品一类,若注明是对一定稀释比例的样液进行测试,那可按照《消毒技术规范》中的滤纸片法进行试验。若要求注明直接对原倍样品进行测试,则此法不宜选用,需要进行适当改进,既要便于试验操作且尽可能减小试验误差,确保数据准确性。


抑菌环试验:牛津杯法


1、菌悬液的制备


将培养18~24小时的新鲜斜面培养物用PBS洗下,利用比浊法稀释至所需使用的浓度,4℃备用。


2、试验平板的制备


向融化并冷至40℃-45℃的培养基中接入试验菌悬液(1%),混匀,使培养基含菌浓度为5×105CFU/mL~5×106 CFU/mL,倾注到平皿内,每皿约15mL-20 mL,转动平皿,使菌液与培养基混匀,静置凝固。


3、摆放牛津杯


牛津杯(内径6mm、外径8mm、高10mm),以无菌操作将灭菌的牛津杯,等距离均匀垂直放置在培养基上,轻轻加压,使其与培养基接触无空隙,每个平板放3支牛津杯。


4、加入产品


用吸管将牙膏产品加入牛津杯中,由于样品粘稠流动性较差,加样操作要注意,确保加入样品与培养基表面接触无空隙。(与打孔法进行对比试验,加入产品量为0.15ml)


5、培养及测量


盖好平皿,置37℃培养箱,培养16h~18h观察结果。用游标卡尺测量抑菌环的直径并记录。测量抑菌环时,应选均匀而完全无菌生长的抑菌环进行测量,其直径应以抑菌环外沿为界。


抑菌环试验:打孔法


1、菌悬液的制备


将培养18~24小时的新鲜斜面培养物用PBS洗下,利用比浊法稀释至所需使用的浓度,4℃备用。


2、试验平板的制备


向融化并冷至40℃-45℃的培养基中接入试验菌悬液(1%),混匀,使培养基含菌浓度为5×105CFU/mL~5×106 CFU/mL,倾注到平皿内,每皿约15mL-20 mL,转动平皿,使菌液与培养基混匀,静置凝固。


3、培养基打孔


经测量,10-100微升的微量移液器枪头,其孔径与牛津杯内径尺寸几乎一致,因此选用该型号枪头用于培养基打孔。打孔时注意一次打孔,不可转动枪头,防止平板琼脂出现裂缝,对结果造成影响,打完孔用无菌针头将琼脂孔中的培养基挑出,每次用针头后要用酒精灯火焰灼烧灭菌。每个平板均匀打5个孔,4个孔加待测样品,中间1个孔加对照样品。


4、加入产品


用吸管将牙膏产品加入到孔径中,由于样品粘稠流动性较差,加样操作要注意,确保加入样品充满各孔径。(与牛津杯法进行对比试验,加入产品量为0.15ml)


5、培养及测量


盖好平皿,置37℃培养箱,培养16h~18h观察结果。用游标卡尺测量抑菌环的直径并记录。测量抑菌环时,应选均匀而完全无菌生长的抑菌环进行测量,其直径应以抑菌环外沿为界。


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